飼料中黃曲霉毒素B1檢測方法

一、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

（1）儀器

微孔板酶標儀(450 nm/630 nm)

氮氣吹干裝置

振蕩器

離心機

渦旋儀

粉碎機

電子天平（感量0.01 g）

（2）器材

單道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）試劑

黃曲霉毒素B1試劑盒。

二、溶液的配制

樣本前處理需配制：

配液1：樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9 體積比進行稀釋（1 份濃縮樣品稀釋液+9 份去離子水）。

配液2：洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9 體積比進行稀釋（1 份濃縮洗滌液+9 份去離子水）。

配液3：樣品提取液：用去離子水將甲醇按3 : 2 體積比進行稀釋（3 份甲醇+2 份去離子水）用于提取樣本中的黃曲霉毒素。

三、樣本前處理方法

樣本處理前須知：

處理任何樣本時，都須注意：

（1）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟：

（A）谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）及配合飼料

1. 取5 g 粉碎樣品，加入25 mL 樣品提取液；

2. 充分振蕩混勻5-10 min；

3. 4000 r/min 離心5 min，或用定量分析濾紙過濾；

4. 取0.2 mL 離心后的上清液或過濾后的濾液加入到1 mL 樣

品稀釋液中進行稀釋并充分混勻；

5. 取50 μL 稀釋后的樣品待測。

稀釋倍數(shù)：30

（B）花生、花生餅等油脂高的飼料

1. 取5 g 粉碎的樣品，加入20 mL 石油醚或正己烷和25 mL樣品提取液；

2. 充分振蕩混勻5-10 min；

3. 離心或靜置分層后去除上層液體；

4. 取0.2 mL 下層液體加入到1 mL 樣品稀釋液中進行稀釋并充分混勻；

5. 取50 μL 稀釋后樣品待測。

四、酶聯(lián)免疫檢測步驟

測定前須知：

1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。

2、使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

3、在使用中不要讓微孔干燥。

4、在ELISA 分析中的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA 測定程序中的要點。

5、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

測定步驟：

1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30 min，每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2個平行試驗。

2、加標準品：加標準品/樣本50 L 到對應(yīng)的微孔中，再加入酶標記物50 L/孔，然后再加入50 L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30 min。

3、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液250μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗滌4~5 次，用吸水紙拍干。

4、顯色：加入底物液A 液50 μL/孔，再加底物液B 液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境反應(yīng)15 min。

5、測定：每孔各加50 μL 終止液，設(shè)定酶標儀在450 nm 處，測定OD 值（建議用450/630 nm 雙波長檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）。